Il museo nasce come quadreria dell'Accademia di Belle Arti, l'istituto d'Istruzione sorto nel 1804 sulle ceneri della settecentesca Accademia Clementina. L'antico nucleo proveniente dall'Istituto di Scienze, donato da Francesco Zambeccari nel 1762, venne arricchito dalla straordinaria raccolta di dipinti frutto delle soppressioni napoleoniche di chiese e conventi bolognesi, compiute tra il 1979 e il 1810. Negli spazi di quello che era stato il convento gesuitico di S. Ignazio, la Pinacoteca conobbe per tutto l'800 un incremento di sale e di opere, frutto di acquisti e lasciti, tra cui il secondo massiccio nucleo Zambeccari, giunto nel 1883. L'ultimo adeguamento delle sale si deve all'architetto Leone Pancaldi sotto la guida dell'allora direttore Cesare Gnudi. Il percorso di visita si snoda tra le ricche testimonianze del Trecento bolognese, con opere di Vitale e Simone dei Crocefissi, e del Rinascimento, testimoniato dai ferraresi Francesco del Cossa ed Ercole de Roberti e dal bolognese Francesco Francia. Dal capolavoro dipinto per Bologna da Raffaello (l'Estasi di S. Cecilia) si giunge, dopo le pale del Parmigianino e del Passerotti, alla rivoluzione di fine '500 testimoniata dalle opere di Agostino, Annibale e Lodovico Carracci. Seguono poi i capisaldi del '600 emiliano, con opere di Guido Reni, Domenichino, Albani, Tiarini e Guercino, per concludersi con il '700, aristocratico e popolare, del Crespi, del Creti e dei fratelli Gandolfi