Il primo nucleo della galleria venne istituito nel 1581 dal granduca Francesco I al secondo piano del palazzo costruito dal Vasari. Arricchito da donazioni e acquisti in età medicea e lorenese, passò all'uso pubblico in seguito alla convenzione di Anna Maria Luisa de' Medici (1737). Raccoglie sculture classiche, arazzi, arredi e soprattutto capolavori di pittura dal XIII al XVIII secolo: Madonna Rucellai (Duccio di Buoninsegna), Maestà di S. Trìnita (Cimabue), Madonna d'Ognissanti (Giotto), Adorazione dei Magi (Gentile da Fabriano), Battaglia di San Romano (Paolo Uccello), Ritratti dei Duchi d'Urbino (Piero della Francesca), Trittico Portinari (Hugo van der Goes), Primavera e Nascita di Venere (Botticelli), Adorazione dei Magi (Leonardo), Tondo Doni (Michelangelo), Madonna del Cardellino e Ritratto di Leone X (Raffaello), Venere d'Urbino (Tiziano), Madonna dal collo lungo (Parmigianino), Bacco (Caravaggio). Il Corridoio vasariano, accessibile dal terzo corridoio della galleria, fu costruito dal Vasari nel 1565 per congiungere gli Uffizi con palazzo Pitti, attraverso Ponte Vecchio; accoglie dipinti di artisti italiani (Annibale Carracci, Guido Reni, Artemisia Gentileschi) e stranieri (Rubens, Rembrandt, Van Dyck, Velázquez) e la collezione degli Autoritratti